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注意事項(xiàng)：1．基礎(chǔ)程序；2．?dāng)U增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時(shí)間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)；8．PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。

實(shí)驗(yàn)過程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長(zhǎng)期保存。
4．PCR的電泳檢測(cè)：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測(cè)。
三、注意事項(xiàng)
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行設(shè)立一個(gè)的PCR實(shí)驗(yàn)室。
２．純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡(jiǎn)單越好。
３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。
４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量?jī)?chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。檢測(cè)步驟：
一、 試劑的準(zhǔn)備
從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對(duì)照+1管陽性對(duì)照)，每個(gè)測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 每個(gè)反應(yīng)加入的量 N個(gè)反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設(shè)定的N個(gè)PCR反應(yīng)管中分別加入15μL熒光PCR反應(yīng)液，向每管中加入處理后樣品或陰性對(duì)照(NTC)和陽性對(duì)照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時(shí)離心10秒。
7.2 qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴(kuò)增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時(shí)收集熒光信號(hào)。報(bào)告基團(tuán)：設(shè)置為FAM。淬滅基團(tuán)：NONE，請(qǐng)勿選擇ROX參比熒光。
組成及試劑配制:
1、酶標(biāo)板：一塊（96孔）
2、 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶，請(qǐng)臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋），分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標(biāo)準(zhǔn)品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測(cè)稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測(cè)稀釋液B：1×10ml。
他唑巴坦鈉 (標(biāo)準(zhǔn)品)Phospho-Bad (Ser112) Blocking Peptide1-芐基-5-氧-吡咯烷羧酸甲酯

D-環(huán)絲氨酸Phospho-GSK-3α (Ser21) Blocking Peptide反式

D-環(huán)絲氨酸(標(biāo)準(zhǔn)品)CD38 (HIT2) Mouse mAb (PerCP-Cy5.5® Conjuga)-甲酸

鹽酸四環(huán)素IDO (D5J4E™) Rabbit mAb (PE Conjuga)硝基鄰二

鹽酸四環(huán)素(標(biāo)準(zhǔn)品)Phospho-IRF-3 (Ser396) (D6O1M) Rabbit mAb (Alexa Fluor® 647 Conjuga)

嘌呤霉素Phospho-IRF-3 (Ser396) (D6O1M) Rabbit mAb (Alexa Fluor® 647 Conjuga)喹唑啉

鈉/羧芐西林鈉β-Tubulin Blocking Peptide2-甲基-5-嘧啶甲酸

羧芐西林鈉(標(biāo)準(zhǔn)品)Cytochrome c Blocking Peptide2-溴-噻唑羧酸

芬達(dá)唑；硫咪唑COX IV Blocking Peptide2-氨基-5-甲酸甲酯

芬達(dá)唑；硫咪唑(標(biāo)準(zhǔn)品)Mre11 Blocking Peptide溴-2-吡啶

前列鈉(D型）PU.1 Blocking Peptide氟-5-

前列鈉(DL型）Survivin Blocking Peptide9,10-二溴蒽

鹽酸川芎(標(biāo)準(zhǔn)品)Phospho-Stat1 (Tyr701) Blocking Peptide2-肼基甲酸鹽酸鹽

鹽酸川芎Phospho-Akt Isoform Antibody Sampler Kit6-溴吲哚

頭孢氨芐Jak2 Blocking Peptide(1,二氧戊環(huán)-2-基)甲基三基溴化瞵

頭孢氨芐(標(biāo)準(zhǔn)品)Bim (C34C5) Rabbit mAb (Alexa Fluor® 647 Conjuga)鄰氟

赤霉素GA3GITR (D5V7P) Rabbit mAbN-芐基-氧代哌啶-羧酸酯鹽酸鹽

霉素HDAC6 (D2E5) Rabbit mAb (PE Conjuga)羥基-甲氧基

P選擇素(P-Selectin/CD62P)ELISA試劑盒Cortactin  皮層肌動(dòng)蛋白100 ul

P物質(zhì)受體(SP-R)ELISA試劑盒phospho-Cortactin (Tyr466)  酸化皮層肌動(dòng)蛋白100 ul

P物質(zhì)(SP)ELISA試劑盒Claudin 5  緊密連接蛋白5100 ul

P糖蛋白/滲透性糖蛋白(P-gp)ELISA試劑盒Claudin-11  少突膠質(zhì)細(xì)胞跨膜蛋白100 ul

p53(p53)ELISA試劑盒Claudin 1  緊密連接蛋白1(C端)20 ul

opiorphin ELISA試劑盒COMP/EPD1  軟骨寡聚基質(zhì)蛋白1 Kit

N-酰基-絲氨酰-天門冬酰-賴氨酰-脯氨酸(AcSDKP)ELISA試劑盒COX1  氧化環(huán)化酶1100 ul

N-酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)ELISA試劑盒Cyclooxygenase 2/COX2  過氧化物合成酶2100 ul

N端前腦鈉素(NT-proBNP)ELISA試劑盒CDX2  尾型同源盒轉(zhuǎn)錄因子2100 ul
流感嗜血桿菌B型PCR檢測(cè)試劑盒規(guī)格鐵調(diào)節(jié)蛋白1抗體Triacetonamine hydrochloride中文名：別名：2,2,6,6-Tetramethyl-4-piperidine hydrochloride分子式：C9H18Cl

錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域蛋白33B抗體Aristolactam BIII中文名：馬兜鈴內(nèi)酰胺BIII別名：分子式：C18H154

細(xì)胞凋亡增強(qiáng)核酸酶抗體10-Hydroxyscandine中文名：10-羥基斯坎定別名：分子式：C21H22N2O4

染色體脆弱性相關(guān)基因抗體Proline中文名：別名：分子式：C5H92

銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)β鏈抗體Aurantiamide中文名：橙黃胡椒酰胺別名：分子式：C25H26N2O3