小鼠ELISA試劑盒采用雙抗體夾心法，單抗包被于酶標板上，標本和標準品中的小鼠試劑會與單抗結合，游離的成分被洗去。加入生物素化的抗小鼠試劑抗體和辣根過氧化物酶標記的親和素，生物素與親和素特異性結合;抗小鼠試劑抗體與結合在單抗上的小鼠試劑結合而形成免疫復合物，游離的成分被洗去。加入顯色底物，若反應孔中有小鼠試劑，辣根過氧化物酶會使無色的顯色劑現藍色，加終止液變黃。在450 nm處測OD值，小鼠試劑濃度與OD450值之間呈正比，可通過繪制標準曲線求出標本中小鼠試劑的濃度。
小鼠ELISA試劑盒中一般有兩次抗原抗體反應，即加標本和加酶結合物后。抗原抗體反應的完成需要有一定的溫度和時間，這一保溫過程稱為溫育，有人稱之為孵育，在ELISA試劑盒中似不恰當。
ELISA試劑盒屬固相免疫測定，抗原、抗體的結合只在固相表面上發生。以抗體包被的夾心法為例，加入板孔中的標本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結合的機會，只有最貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。這是一個逐步平衡的過程，因此需經擴散才能達到反應的終點。在其后加入的酶標記抗體與固相抗原的結合也同樣如此。這就是為什么ELISA試劑盒反應總是需要一定時間的溫育。
溫育常采用的溫度有43℃、37℃、室溫和4℃等。37℃是實驗室中常用的保溫溫度，也是大多數抗原抗體結合的合適溫度。在建立ELISA試劑盒方法作反應動力學研究時，實驗表明，兩次抗原抗體反應一般在37℃經1-2小時，產物的生成可達頂值。為加速反應，可提高反應的溫度，有些試驗在43℃進行，但不宜采用更高的溫度。抗原抗體反應4℃更為*，在放射免疫測定中多使反應在冰箱中過夜，以形成最多的沉淀。但因所需時間太長，在ELISA試劑盒中一般不予采用。
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更新時間：2021-04-13
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