RT-PCR試劑盒的PCR反應(yīng)及注意事項說明

更新時間：2022-06-27

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　　RT-PCR試劑盒合適的溫度通常在45-68℃之間(預(yù)備實驗可2℃間隔進行)。另外，由于在60-68℃間，也有很高的活性，因此可在此溫度范圍內(nèi)設(shè)定溫度，進行2 Step PCR。

　　RT-PCR試劑盒是為兩步法RT-PCR一步實驗配制的，具有高靈敏度的RT-PCR反應(yīng)系統(tǒng)，可以從極低量的總RNA或poly(A)+RNA合成一鏈cDNA。與PCR反應(yīng)相結(jié)合，可用于檢測稀有基因的表達(dá)、從極少量細(xì)胞中定量檢測特定mRNA的表達(dá)水平、克隆特定基因的cDNA片段等。合理配備與cDNA一鏈合成反應(yīng)相關(guān)的各種組分，該試劑盒有高效的逆轉(zhuǎn)錄酶活性，對后續(xù)的PCR或定量PCR實驗兼容性好，適合于各種PCR耐熱聚合酶。

　　RT-PCR試劑盒試驗時進行的PCR反應(yīng)：

　　1.吸取10%的一鏈反應(yīng)液（2μl）進行PCR反應(yīng)；即使加入更多量的一鏈反應(yīng)液也不能增加其擴增的產(chǎn)物量，反而可能會抑制正常的PCR反應(yīng)；

　　2.94℃加熱變性2min；

　　3.設(shè)置15-40個PCR循環(huán)。退火與延伸條件依引物和模板而定。

　　相關(guān)注意事項：

　　1.用于cDNA合成反應(yīng)的溶液試劑盡量可能用DEPC進行處理，并在高壓滅菌后使用。有些試劑不能高壓滅菌時，首先用經(jīng)過滅菌的器具、水等配制溶液后，再將溶液進行過濾除菌處理。

　　2.RNA樣品要避免基因組DNA污染。

　　3.避免多次反復(fù)凍融RNA，使RNA保持在冰浴中處融化狀態(tài)。

　　4.試劑盒的各組成成分應(yīng)在-20℃保存。

　　5.cDNA產(chǎn)物應(yīng)置于-20℃保存。